1 % Abweichung, 40 % Pehler: So wichtig ist Durchflussmessung

VERFASST VON Carlo Dessy, Geschaftsfiihrer Testa Analytical Solutions

Published in Laborpraxis – April 2025

1: Wie kleine Schwankungen beim Durchfluss für große Probleme sorgen, verdeutlicht dieser Beitrag

Kalibrierungen sind Pflicht für wiederholgenaue Ergebnisse. Dach gerade aufwendige Messreihen wie in der Gel-Permeations-Chromatographie dauern oft Lange, sodass die tatsächliche Flussrate minimal abweichen kann. Welch enorme Folgen dies nach sich zieht, zeigt das folgende Beispiel.

Eine der leistungsfahigsten Techniken flir die Charakterisierung natlirlicher und synthetischer Polymere ist sicherlich die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC), auch bekannt als Größenausschluss-Chromatographie (Size Exclusion Chromatography, SEC). Ihre Flexibilität und der Informationsgehalt einer einzigen Messung machen sie zur Technik der Wahl flir vielfältige Applikationen, von der einfachen Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung und der Polydispersitat bis hin zur komplexesten Strukturanalyse oder der Verteilung der Co-Polymerzusammensetzung.

Ein großer Vorteil der GPC/SEC als Analytikmethode ist ihre Einfachheit. Ein typisches Einstiegssystem, das aus einer Pumpe, einem manuellen Injektor, einer Saule und einem Brechungsindexdetektor sowie einigen Referenzstandards besteht, ist alles, was man braucht, um eine zuverlässige Analysemethode zu etablieren. Die Erweiterung mit zusätzlichen Säulen und massensensitiven Detektoren - z. B. ein Viskosimeter oder/und ein Detektor zur Mehrwinkellichtstreuung (Multi Angle Light Scattering, MALS) - verbessert die Möiglichkeiten eines solchen Systems exponentiell und eröffnet den Weg zu komplexeren Anwendungen und dichterem Informationsgehalt.

Die Kalibrationskurve als Ausgangspunkt

Sehr häufig beruhen die Ergebnisse auf einer Kalibrierungskurve, die durch einen Satz von Referenzstandards mit bekanntem Molekulargewicht (Molecular Weight, MW) und enger MW-Verteilung erhalten wird. Dies ist zumindest in den Fällen zutreffend, in denen ein Brechungsindexdetektor (Refractive Index Detector, RID) der einzig verfügbare Detektor ist. Die Kalibrierungskurve wird dann durch Auftragen des nominalen Molekulargewichts gegen das durch die Messung bestimmte Peak-Elutionsvolumen erstellt (s. Abb. 2).

In ähnlicher Weise lässt sich bei Verwendung eines Viskosimeters zum Nachweis eine universelle Kalibrierung erstellen. Dazu wird das Produkt aus nominalem Molekulargewicht und gemessener intrinsischer Viskosität gegen das ermittelte Peak-Elutionsvolumen aufgetragen (s. Abb. 3).

In beiden Fällen basiert das berechnete Molekulargewicht einer unbekannten Probe auf ihrem berechneten Elutionsvolumen und anhand der Kalibrierungskurve. Es ist nun wichtig zu bedenken, dass GPC/SEC-Messungen i. d. R. zeitaufwendig sind und je nach absoluter Durchflussrate und Anzahl der verwendeten Säulen im System zwischen rund 45 Minuten bis zu mehreren Stunden dauern können. Daher ist es üblich, die erforderlichen Standards und unbekannten Proben an verschiedenen Tagen oder sogar Wochen durchzuführen, sodass sich ein sehr loses Zeitverhältnis zwischen Kalibrierung und Probenmessung ergibt. In Anbetracht dessen liegt es auf der Hand, dass jede Abweichung der Durchflussrate zwischen den Durchläufen der Standards und der Probe das endgliltig ermittelte Molekulargewicht beeinflussen wird. Die Frage lautet dann: "Wie groß ist dieser Einfluss?" und "Welche Abweichung darf ich tolerieren, bevor eine Neukalibrierung erforderlich ist?"

Wie verlässlich ist die Messung wirklich?

In einer typischen Laborumgebung ist die Genauigkeit der Flussrate, bei den meisten verwendeten HPLC-Pumpen, Vertrauenssache. Da eine HPLC-Pumpe i. d. R. nur einmal im Jahr überprüft und validiert wird, geht man häufig davon aus, dass sie in der Lage ist, die gewlinschte exakte Flussrate Uber einen langen Zeitraum hinweg ohne nennenswerte Abweichungen zu liefern. Oft wird der von der HPLC-Pumpe gemeldete Gegendruck als Referenz und Bestätigung für einen einwandfreien Betrieb herangezogen. In Anbetracht der Vielzahl von Parametern, die den gemeldeten Gegendruck beeinflussen können (Temperatur, Zustand der Säulen und Leitungen, Qualität des Löisungsmittels, um nur einige zu nennen). hat dieser Parameter jedoch nur eine begrenzte Aussagekraft für die Genauigkeit des Durchflusses in einem Langzeitbetrieb (die meisten GPC/SEC-Systeme laufen wochenlang rund um die Uhr), da eine Abweichung von einem Prozent beim Gesamtgegendruck scheinbar unauffällig ist.

4: Molekulargewichtsverteilung bei korrekter Durchflussrate

5: Vergleich der Molekulargewicht-Ergebnisse zum soll-Durchfluss von 1,00 ml/min, links: fi.ir die Standardkalibrierung. rechts: fi.ir die universelle Kalibrierung

In diesem Beitrag untersuchen wir die Auswirkungen einer Abweichung von einem Prozent bei der Durchflussrate auf die Ergebnisse für eine unbekannte Probe, die sowohl mit einer Standardkalibrierung als auch mit einer universellen Kalibrierung bestimmt wurde. Wir haben eine so geringe Abweichung gewählt, da sie, umgerechnet in Gegendruck flir ein typisches GPC/SEC System, oft unter der Nachweisgrenze des Druckwandlers der Pumpe liegt und somit mit Bordmitteln nicht nachweisbar ist.

Kleiner Fehler, große Folgen

Für den Test wurde eine Probe direkt nach der Kalibrierung gemessen und anschließend der fiir die Berechnung verwendete Durchflussparameter manuell geändert. Dies wurde für eine zweite Probe wiederholt, wobei diesmal ein Viskositätsdetektor und universelle Kalibrierung zum Einsatz kamen (s. Abb. 4).

Abbildung5, linker Teil, zeigt deutlich, wie sich der positive und negative 1%-Fehler auf die erhaltenen Molekulargewichte auswirkt. Die nominale Durchflussrate (und diejenige, mit der die Standards für die Kalibrierung durchgeführt wurden) betrug 1,000 mL/min. Die Berechnungen wurden daher bei 1,000, 1,010 und 0,990 mL/min durchgeführt.

Die obigen Ergebnisse belegen, dass sich bereits eine Abweichung von einem Prozent bei der Durchflussrate signifikant auf die Molekulargewichtsergebnisse auswirkt und zu einer Änderung von insgesamt über 20 Prozent führt. Dieser Effekt mag auf den ersten Blick überraschen, lässt sich jedoch durch die Tatsache erklären, dass das Molekulargewicht auf der Kalibrierungskurve ein logarithmischer Wert ist, der gegen den linearen Wert des Elutionsvolumens aufgetragen wird.

6: Molekulargewichtsverteilung. berechnet an hand der Universalkalibrierung (and ere Probe als in Abb-4)

Ein grundlegender Parameter für jede Polymerprobe ist die Polydispersität, definiert als das Verhältnis von Massenmittel und Zahlenmittel der Molmasse Mw /Mn . Es ist daher von großem Interesse, die Auswirkungen einer kleinen Abweichung der Flussrate auf dies en wichtigen Wert zu untersuchen. Die Ergebnisse für das obige Beispiel sind in Tabelle 1 zu finden. Sie zeigen, dass die Polydispersität nur geringfügig von der Abweichung der Fließgeschwindigkeit beeinflusst wird.

Nach der Bewertung des Effekts auf der Grundlage einer Standardkalibrierung ist es interessant, die Bewertung auf der Grundlage eines Stichprobenlaufs gegen eine universelle Kalibrierung zu wiederholen (s. Abb. 6). Auch hier wurden positive und negative einprozentige Abweichungen von der korrekten Flussrate untersucht; die Ergebnisse sind rechts in Abbildung5 zusammengefasst.

Fazit: Durchflussraten messen statt raten

Die Auswirkungen einer kleinen Flussratenabweichung sind unglaublich groß (insgesamt über 40%) auf ein System, das eine universelle Kalibrierung als Berechrl nungsgrundlage verwendet. Auch im Falle der "konventionellen" Kalibrierung, führen kleine Abweichungen der Flussrate zu inakzeptablen Ergebnissen. Dies unterstreicht deutlich, wie wichtig es ist, die aktuellen Durchflussraten ständig zu überwachen und mit einer geeigneten Methode das la ufende Chromatogramm zu korrigieren.

Diese einfachen Experimente zeigen die Bedeutung eines genauen und über die Zeit konstanten Durchflusses. Gleichzeitig verdeutlichen sie, dass bordeigene Mittel, wie der von der Pumpe gemeldete Gegendruck, für eine zuverlässige Beurteilung des Zustands der Pumpe selbst und damit des aktuell geförderten Durchflusses nicht ausreichen. Die Fehler in den ermittelten Molekulargewichten sind bei weitem nicht einfach zu ignorieren oder zu akzeptieren, insbesondere, weil moderne Mittel zur kontinuierlichen Überwachung des aktuellen Durchflusses in Form von nicht-invasiven Durchfluss­messern ohne weiteres zur Verfügung stehen. (clu)